湖北省襄阳市中心医院李静/裴宇团队在BMC Medicine期刊上发表了题为“Downregulated lysyl oxidase in plasma extracellular vesicles: a biomarker linked to brain metastasis risk in lung adenocarcinoma”的文章，研究发现：赖氨酰氧化酶( LOX )是ECM交联的关键酶，被确定为先导候选物。LOX及其家族成员LOXL1在脑转移（BrM）组织和血浆EVs中持续下调。

单细胞分析显示，在BrM相关的成纤维细胞中特异性地降低了LOX的表达，表明其抑制了ECM相关的通路。体外实验支持PI3K / AKT - LOX - ECM调控轴。在158例独立验证队列中，血浆EV来源的LOX的曲线下面积（AUC）为0.786，优于直接检测血浆LOX（AUC=0.665），联合模型AUC为0.798 。

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研究背景

肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因，在恶性肿瘤中发病率最高。非小细胞肺癌( non-small cell lung cancer，NSCLC )约占肺癌的85 %。与鳞状细胞癌相比，肺腺癌( LUAD )具有更高的脑转移倾向，30 % ~ 50 %的患者发生脑转移。这种元静态趋势可能与LUAD不同的驱动基因谱和血行播散模式有关。BrM会导致患者发生严重的神经功能缺损并降低生活质量，且目前的治疗仍然大部分无效，尽管高分辨率MRI和CT等先进的成像技术提高了无症状BrM的早期发现，但它们造成了巨大的经济负担。因此，迫切需要确定早期识别LUAD - BrM的非侵入性生物标志物，并阐明其分子机制，以利于及时干预，改善患者预后。

本研究旨在为监测高危人群提供一种新的液体活检工具，并为阐明LUAD - BrM的分子机制和开发EV靶向治疗奠定基础。

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论文创新点

多组学整合策略：首次系统性地结合EV蛋白组学、组织蛋白组学、单细胞转录组学、机器学习和体外功能验证，筛选并验证LUAD脑转移相关生物标志物。

最大样本量：共纳入216名IV期LUAD患者，是目前该领域最大规模的EV生物标志物研究。

机制与标志物结合：不仅发现了LOX可以作为LUAD的诊断标志物，还提出PI3K/AKT-LOX-ECM调控轴，并揭示了其潜在机制。

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研究结果总结

通过尺寸排阻色谱成功分离出典型形态、粒径40–130 nm、表达CD9/CD81/TSG101的EVs。
在59例IV期LUAD患者（30例脑转移 vs 29例非脑转移）中鉴定出2230种蛋白，其中35个为差异表达蛋白（26个上调，9个下调）。
下调蛋白显著富集于“胶原蛋白细胞外基质”相关通路，提示ECM降解可能促进脑转移。
通过蛋白组学和测序等方法，最终锁定了赖氨酰氧化酶（LOX）为核心候选蛋白。
LOX及其家族成员LOXL1在脑转移患者肺组织中下调，单细胞测序分析显示，其低表达主要存在于成纤维细胞中，伴随ECM通路抑制。
体外实验提示PI3K/AKT信号通路抑制LOX表达，导致胶原蛋白I和α-SMA下降，破坏ECM完整性，可能削弱血脑屏障。
临床验证：在158例独立验证队列中，血浆EV来源的LOX的曲线下面积（AUC）为0.786，优于直接检测血浆LOX（AUC=0.665），联合模型AUC为0.798。

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文章主要结果展示

① 血浆外泌体的表征和蛋白组学分析

对随机选取的两份样本中获得的血浆来源外泌体（EVs）进行鉴定和蛋白质组学分析。

（A，B）Tem图像。

（C）颗粒分布。

（D）外泌体蛋白的免疫印迹条带图像。

将鉴定到的蛋白与Exocarta和Vesiclepedia数据库中的蛋白进行（E）Venn图比较。

将鉴定到的蛋白质的（F）venn图与Exocarta和Vesiclepedia数据库中的TOP 100蛋白质进行比较。

（G）来自两个数据库的前10个蛋白的阳性表达率。

（H）Br M组相对于非BrM组的DEEP数。

（I）火山图。

（J）与 LUAD -BrM相关的上调和下调最显著的外泌体蛋白的表达模式。

② 血浆外泌体蛋白质组学谱的生物信息学分析

DEEPs的功能和通路富集图谱。

（A）DEEPs的GO富集。

（B）DEEPs的Reactome通路富集。

（C）GSEA。

（D）GSEA富集图：含胶原蛋白的细胞外基质。

③ 核心差异表达蛋白筛选

与LUAD - BrM相关的DEEPs的PPI分析。

（A）利用STRING数据库构建DEEPs的PPI网络。

（B）使用五种不同的网络拓扑算法从候选池中识别枢纽蛋白。

（C）由GeneMANIA数据库生成的16个hub蛋白质扩展而来的功能关联网络。

（D）整合Sankey - foam图可视化16个hub蛋白与其GO / KEGG通路之间的对应关系。

④ FFPE 组织蛋白质组学的综合分析

整合分析FFPE组织蛋白质组学并验证LOX家族在LUAD - BrM中下调。

（A、B）在组织( BrM vs non-BrM , 5 vs 8)中鉴定出的差异表达蛋白( DEPs )的聚类热图和火山图。

（C）DEPs的数量。

（D）Venn图，说明组织蛋白质组学的DEPs与血浆EV蛋白质组学的3个hub蛋白质之间存在重叠。

（E）FPR1在组织和血浆EVs中的表达。

（F）LOXL1在FFPE组织中的表达及LOX在血浆EVs 中的表达。

（G）整合多组学数据的LOXL1与LOX的PPI网络。

（H）基于TCGA数据对LOXL1和LOX表达水平进行关联分析。

（I）代表LOX、LOXL1、Collagen I和α - SMA在三组组织中的IHC染色图像。

（J）定量分析LOX、LOXL1、Collagen I和α - SMA在三组组织中的IHC染色强度。

⑤ NSCLC 中LOX的单细胞转录组分析及其与细胞外基质通路的关联

LOX在NSCLC中的单细胞转录组学分析及其与ECM通路的关系。

（A，B）LOX的表达分布情况，主要见于代表性BrM数据集（GSE143423和GSE150660）及原位数据集（GSE127465和GSE148071）中的成纤维细胞区域。

（C）基于两个NSCLC原位数据集，对LOX高表达与LOX低表达成纤维细胞中ECM组装与重塑通路的GO富集分析。

⑥ 肺成纤维细胞中PI3K/ AKT -LOX-ECM调控轴的功能验证

肺成纤维细胞中PI3K / AKT - LOX - ECM调控轴的功能验证。

（A-D）基于单细胞RNA测序数据，比较LOX低表达与LOX高表达成纤维细胞中PI3K/ AKT 信号通路活性的富集情况。

（E，F）功能分析确定PI3K是LOX的上游抑制因子，LOX是MRC - 5细胞ECM表达的调节因子。

⑦ 通过 ELISA 和Western blot验证LOX表达

LOX下调的验证及其作为 LUAD -BrM血浆外泌体生物标志物的效能诊断。

（A、B）独立验证队列（BrM vs 非BrM，79例 vs 79例）中血浆外泌体与全血浆样本的LOX表达水平。

（C）基于血浆外泌体LOX、全血LOX及联合模型区分 LUAD -BrM的受试者ROC曲线及AUC值。

（D、E）通过Western blot验证6例随机患者（BrM vs 非BrM，3例 vs 3例）的原发性肺肿瘤组织及血浆外泌体中LOX与LOXL1蛋白的下调情况。

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