外泌体是一种包裹有大量蛋白质、脂质、各种RNA以及DNA等物质的胞外囊泡结构，由内体膜内陷产生，其存在于人体多种体液中，例如血液、脑脊液、尿液、支气管肺泡灌洗液、乳汁等，并通过自分泌、旁分泌的方式作用于临近细胞，或通过血液循环传递至远端细胞，介导细胞间的物质交换与信息交流，有助于了解细胞生理学和病理学过程，并且在临床检测和疾病治疗方面具有显著的潜力。同时，外泌体可以参与体内多种生物学过程，在免疫调节、肿瘤细胞凋亡与迁徙、病毒感染与传播、炎症反应、神经修复等过程中发挥着关键作用。此外，由于外泌体为较小的脂质双分子层结构，可作为药物递送载体，提高药物吸收率。

因此，外泌体的分离鉴定显得尤为重要，小编整理了两篇湖北医药学院桑明教授编写的关于外泌提取方法的文章，进行了文献解读，希望给大家提供新的科研思路。

脐带血在胎儿娩出后往往和脐带及胎盘一起被视为医疗废物，脐带血易于采集，对供体无伤害，且脐带血免疫细胞处于原始阶段，脐带血间充质干细胞具有免疫原性低、移植后免疫排斥反应发生率低等优点。目前应用最多的依然是干细胞移植，可用来治疗多种血液系统疾病、免疫系统疾病和先天性代谢疾病等，在帕金森病、肝病、软骨软化症、阿尔兹海默症、退行性关节炎、糖尿病等疾病领域也有涉及。在分离脐带血中单个核细胞的同时，脐带血血浆也是可利用的难得资源，其中包含蛋白、酶以及细胞分泌的活性分子等成分，也包括外泌体 (exosomes)。从人脐血血浆中分离纯化出的外泌体兼顾免疫原性低和纳米载体的特征，具有巨大的应用潜力。

技术路线

图1 四种UCB-Exos提取方法流程示意图

(A) Ultracentrifugation.

(B) Sucrose pad density gradient centrifugation.

(D) PEG precipitation.

图2 4 种方法提取 UCB-Exos 的操作时间

1: ultracentrifugation;

2: sucrose pad density gradient centrifugation;

3: improved ultracentrifugation;

4: PEG precipitation.*P<0.001.

结果：超高速离心法、蔗糖垫密度梯度离心法、改良超速离心法、PEG 沉淀法提取 UCB-Exos 所需操作时间分别为：(251.67±11.50) min、(560.67± 13.43) min 、 (378.33±11.37) min 、(136.67± 9.61) min。结果表明，蔗糖垫密度梯度离心法耗时最长，PEG沉淀法相对耗时最短 (图 2)

图 3 4 种方法提取的 UCB-Exos 电镜图

(A) ultracentrifugation.

(B) sucrose pad density gradient centrifugation.

(D) PEG precipitation. Scale bar: 500 nm and 100 nm.

结果：TEM 检测结果表明，4 种方法提取的囊泡物质均可见脂质双分子层结构和典型杯状结构，表明 4 种方法均成功提取出 UCB-Exos。相比之下，超高速离心法提取的 UCB-Exos 相对较少，而其他 3 种方法提取的外泌体量稍多，其中，PEG 沉淀法提取的 UCB-Exos 最多，但杂质蛋白也多 (图 3)。

图 4 动态光散射技术检测 UCB-Exos 粒径大小

1: ultracentrifugation;

2: sucrose pad density gradientcentrifugation;

3: improved ultracentrifugation;

4: PEG precipitation.

结果：通过动态光散射检测 4 种方法提取的囊泡颗粒纳米粒径，其中，超高速离心法和蔗糖垫密度梯度离心法提取的囊泡结构纳米粒径大部分在 200 nm 以内，粒径大小较标准，而改良超速离心法和 PEG 沉淀法提取的囊泡结构纳米粒径稍偏大，且PEG 沉淀法可见约 20−30 nm大小的囊泡颗粒，表明 PEG 沉淀法提取UCB-Exos 中可能存在如脂蛋白的污染。动态光散射检测结果如图 4 所示。

图 5 BCA法检测不同方法提取的 UCB-Exos 总蛋白浓度

1: ultracentrifugation;

2: sucrose paddensity gradient centrifugation;

3: improvedultracentrifugation;

4: PEG precipitation. *P< 0.005, **P<0.001.

结果：超高速离心法、蔗糖垫密度梯度离心法、改良超速离心法、PEG 沉淀法提取的 UCB-Exos总蛋白浓度分别为：(0.48±0.03) μg/μL、(0.7±0.06) μg/μL、(0.85±0.06) μg/μL、(3.17±0.49) μg/μL。超高速离心法提取的 UCB-Exos 总蛋白浓度较低，改良超速离心法、蔗糖垫密度梯度离心法获取的 UCB-Exos 总蛋白浓度高于超高速离心法，PEG 沉淀法提取的蛋白总浓度最高 (图 5)。

图 6 Western blotting 检测不同方法提取的 UCB-Exos 相关蛋白的表达水平 Exos-1、Exos-2、Exos-3表示 3 个不同供体来源脐带血血浆中提取分离出的外泌体

1: ultracentrifugation;

2: sucrose pad density gradient centrifugation;

3: improved ultracentrifugation;

4: PEGprecipitation. Exos-1, Exos-2, Exos-3: exosomes extracted and isolated from three plasma of umbilical cordblood samples.

结果：Western blotting 结果显示，4 种方法提取的 UCB-Exos均表达外泌体表面标志蛋白 CD63、 HSP70，不表达高尔基体相关蛋白 GM130，结果符合外泌体化学特征。从蛋白 marker 的表达量来看，超高速离心法提取的 UCB-Exos 量较少，PEG 沉淀法提取的量较多，此外，不同供体来源的脐血血浆中 UCB-Exos 量有所差异，蔗糖垫密度梯度离心法相对较稳定 (图 6)。

综上所述，对于 UCB-Exos 的提取，应结合实验室仪器设备条件、实验对 UCB-Exos 量、纯度的要求，选择合适的提取方法。在仪器设备允许的情况下，蔗糖垫密度梯度离心法不仅保证了 UCB-Exos 的质量，且稳定性较好，但该方法操作复杂，需要富有经验的实验人员才能保证提取质量，如果能针对蔗糖垫密度梯度离心法开发出操作简便的提取试剂盒可在提高提取效率的同时，保证 UCB-Exos 的提取质量。

细胞通过内体途径和质膜出芽的方式释放出大小不同的囊泡，这些囊泡有多种名称，包括外泌体、微泡、微粒等，统称为细胞外囊泡 ( extracellular vesicles，EV) 。而外泌体是通过内体途径中的多泡体出芽释放的直径为30～150 nm 的小型 EV。外泌体可由多种细胞分泌并释放到体液中，如血清、尿液、脑脊液、母乳、房水和羊水。外泌体中含有多种蛋白，如四次跨膜蛋白 CD9、TSG101、flotillin-1 等;外泌体也含有核酸如DNA、mＲNA、微小ＲNA ( microＲNA，miＲNA) 、非编码ＲNA以及脂质。外泌体作为细胞间通讯的关键介质，可将信息传递至受体细胞，通过配体-受体方式与靶细胞相互作用，参与多种生物过程，如免疫调节、病毒感染或肿瘤微环境的改变。外泌体有助于了解细胞生理学和病理学过程，并且在临床检测和疾病治疗方面具有显著的潜力。因此，外泌体的分离鉴定显得尤为重要。

根据外泌体的来源、体积大小等因素，目前已经开发了多种外泌体分离技术，其中超速离心是外泌体提取最常用的方法，但该法费时费力。尺寸排除色谱法与超速离心法相比，可提高血浆源性外泌体的产量。免疫亲和捕获法可用于从特定细胞类型中分离外泌体。PEG沉淀法分离外泌体纯度低，杂蛋白较多。最近，已经开发了依赖于聚合物共沉淀的商业试剂盒，如 ExoQuickTM。这些试剂可降低外泌体的水合作用引起沉淀，沉淀的外泌体通过低离心力重复分离，无需冗长的超速离心，所需体积也更少。本研究以健康人血浆为样本，比较 ExoQuickTM和 Umibio 试剂盒提取血浆外泌体的质量差异。由此选取较为可靠有效的外泌体提取试剂盒，分析不同储存温度、储存时间对血浆外泌体生物学特性及稳定性的影响，确定样本最佳存放条件。

技术路线：

图 1 ExoQuickTM试剂盒及 Umibio 试剂盒提取外泌体流程

A: ExoQuickTM试剂盒;

B: Umibio 试剂盒．

图2 不同试剂盒提取外泌体的操作时间比较

1: ExoQuickᵀᴹ试剂盒提取法;

2: Umibio 试剂盒提取法．ᵃP＜0.05 vs 1．

结果：ExoQuickTM 试剂盒提取法平均耗时 ( 98．2 ± 11．6) min，Umibio 试剂盒提取法平均耗时( 728．4 ± 12．5 ) min。后者操作时间明显高于前法 ( P ＜ 0．05，图2)

图3 不同方法提取外泌体的形态 ( 透射电镜，标尺 =200 nm)1: ExoQuickᵀᴹ 试剂盒提取法;2: Umibio 试剂盒提取法．

结果：两种方法提取的外泌体形态类似，但 Umibio 试剂盒提取法获得外泌体较纯。经透射电镜观察发现，两种方法提取血浆外泌体呈圆形或椭圆形囊泡，大小均在100 nm 左右，与文献报道的30～150 nm 基本一致，形态无明显差异。ExoQuickTM 试剂盒提取法提取的外泌体存在背景污染的情况，考虑为蛋白污染，而 Umibio 试剂盒提取法所得外泌体相对较纯(图 3)

图4 BCA 法检测放置不同温度下，两种方法提取的血浆外泌体蛋白的含量

1: ExoQuickᵀᴹ 试剂盒提取法;

2: Umibio 试剂盒提取法．ᵇP＜0.01 vs 2．

结果：在不同贮存温度下（常温，4℃，-20℃，-80℃）的外泌体，用ExoQuickTM 试剂盒提取法所得的外泌体蛋白质含量均高于 Umibio 试剂盒提取法（图 4) 。

图5 Western blot 法检测不同贮存条件下不同提取方法提取的外泌体标志蛋白 CD9 及 flotillin-1 的表达情况

1: ExoQuickᵀᴹ 试剂盒提取法;

2: Umibio 试剂盒提取法．

结果：两种方法提取的外泌体均可表达CD9、flotillin-1，但在 Umibio 试剂盒提取法提取的外泌体中CD9、flotillin-1蛋白表达丰度高于 ExoQuickTM试剂盒提取法。在储存不同温度下，随着储存时间的延长，外泌体标志蛋白的表达逐渐降低( 图 5) 。

图 6 NTA 检测 Umibio 试剂盒提取的血浆外泌体在不同温度条件下放置 1 周后，其粒径与含量分布

A: NTA 检测不同储存条件下 Umibio 试剂盒提取的血浆外泌体的粒径与含量分布;

B: 在不同储存条件下外泌体粒子含量的比较．

ᵃP ＜ 0． 05 vs 4℃组; ᵇP ＜ 0． 01 vs 常温组; ᶜP ＜ 0． 05 vs － 20℃组．

结果：有透射电镜与BCA法检测结果表明ExoQuickTM 试剂盒提取的外泌体有污染现象，所以以下检测只用Umibio 试剂盒提取外泌体进行检测。外泌体直径在四种储存条件下存在差异，4℃和－ 20℃ 条件下，外泌体直径相对较小。根据浓度比较，在常温、4℃、-20℃、－80℃贮存条件下，放置 1 周后，外泌体的含量在常温条件下最低，在－20℃条件下最高，而在－80℃条件下有所降低。

ExoQuickTM 及 Umibio 法均能成功提取到血浆外泌体，Umibio 法提取的外泌体纯度高于ExoQuickTM法，但操作繁琐，耗时较长。储存时间和温度对外泌体的稳定性亦有影响，存放的温度越高，时间越长，外泌体消耗的更多，而低温保存时，外泌体较为稳定，浓度较高，但存在外泌体发生膨胀并相互融合的情况。因此，用于提取外泌体的血浆样本应新鲜，在提取外泌体后，如不能及时检测，应在低温条件下保存更为合适。外泌体已被证实与肿瘤进展相关，其含有液体活检生物标志物如蛋白、ＲNA 等，在提供癌症诊断信息中发挥着巨大的潜力。因此，根据不同的临床需要，可选择较为合适的提取及保存方法。