NTA实验小技巧，每步都是干货

一、样本制备

1.1 样本纯度不足

问题：外泌体样本中若含有蛋白质聚集体、脂蛋白或细胞碎片，会干扰NTA结果。

对策：

严格纯化步骤：超速离心后建议结合密度梯度离心或尺寸排阻色谱（SEC）进一步纯化（未纯化的话，会有部分跟外泌体粒径差不多的小颗粒在检测的时候会被计数，造成NTA检测浓度结果偏大）。

1.2 样本浓度不当

问题：浓度过高会导致颗粒重叠，浓度过低则信号不足。

对策：

A.预实验确定稀释倍数：NTA上机样本最佳检测范围为10⁶–10⁹ particles/mL，可通过稀释比例调整原始样本到上机样本。

B.稀释液选择：使用与样本兼容的缓冲液（如PBS可能引起聚集，可改用0.1 μm滤过的无外泌体培养基或HEPES缓冲液）。

二、仪器操作

2.1 参数设置错误

问题：激光强度、相机灵敏度或检测时间设置不当会导致数据偏差。

对策：

A.根据样本调整：高浓度样本需降低相机灵敏度或缩短检测时间（如15秒），低浓度样本可延长至60秒。

B.校准仪器：每次检测前用标准乳胶颗粒（如100 nm）校准，确保仪器状态正常。

2.2 样本加载问题

问题：注射器残留气泡、样本未混匀或进样量不足。

对策：

A.充分混匀样本：轻柔涡旋或低速移液，避免剧烈振荡导致外泌体破裂。

B.排除气泡：进样前低速离心注射器或使用无气泡专用注射器。

C.样本检测时间：可视界面颗粒稳定后再点击检测分析。

三、数据分析

3.1 软件阈值设定错误

问题：阈值过高会漏检小颗粒，阈值过低会误判背景噪声。

对策：

A.手动优化阈值：结合动态颗粒追踪视频，确保颗粒轨迹清晰且背景干净。

B.验证粒径分布：外泌体典型粒径为30–200 nm，若出现大量<30 nm颗粒，可能为蛋白质污染或仪器噪声。

四、常见问题与解决方案

五、其他关键建议

5.1 对照实验：

设置阴性对照（如无外泌体缓冲液）和阳性对照（商业化外泌体标准品）。

5.2 多技术联用：

结合电镜（TEM）验证形态，WB检测标志蛋白（如CD63、TSG101）。

5.3 样本保存：

避免反复冻融：分装后-80℃保存，检测前冰上缓慢解冻。