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细胞摄取外泌体实验避坑指南细胞摄取外泌体实验用于探究外泌体进入受体细胞的能力，与外泌体来源、受体细胞种类、摄取时间、外泌体是否有靶向性等均有关。实验过程中常用PKH26（红），PKH67（绿色）染料对外泌体进行标记，用于示踪外泌体，有的也会用鬼笔环肽等标记细胞骨架，激光共聚焦显微镜拍摄。本文对细胞摄取外泌体实验进行部分经验分享。 间充质干细胞、肿瘤细胞、免疫细胞（巨噬细胞）等 荧光标记操作要点 染料的选择：PKH-26/67是常用亲脂膜染料，但游离染料极易黏附细胞产生假象；一般优先选择蛋白标记的方式，降低背景干扰。实验推荐使用PKH26红色荧光，最常用 。 去除游离染料：标记完成后，可通过超速离心去除未结合的游离染料，避免出现严重假阳性。 细胞状态：细胞汇合度维持在40%—60%，细胞密度过大、干扰实验结果，且视野也不好选择。 孵育培养基的选择：选用无外泌体培养基。 孵育的时间： 细胞类型 推荐实验时间 巨噬细胞（RAW264.7） 6h—12h 肿瘤细胞（Huh7、HepG2、MDA-MB-231等） 12h—24h MSC(BMSC、ADSC、UC-MSC) 12h—24h 内皮细胞（HUVEC/LSEC） 24h 成纤维细胞 24h 充分洗涤：孵育结束后，使用预冷PBS轻柔洗涤细胞3—5次，洗去未内化、附着在细胞膜表面的外泌体，避免洗涤不充分造成干扰。 固定透化：采用多聚甲醛（PFA）对细胞进行固定，以保持细胞形态及外泌体荧光信号的稳定性。固定处理需严格控制条件，推荐时间15–20 min。 鬼笔环肽染色：通过鬼笔环肽特异性标记细胞骨架，可完整勾勒细胞形态、细胞质边界，精准区分膜表面黏附情况，大幅提升结果准确性。 完全无荧光信号：外泌体浓度过低、标记效率差、孵育时间不足、荧光发生淬灭。 整体背景荧光很高：标记后游离染料未去除干净，样本杂质过多。 重复性差：外泌体反复冻融降解、细胞状态不稳定。 细胞污染：往往由实验过程中外泌体被污染导致。 参考图： 图1.ThESCs(24h) 图2.HC(24h) 图3.HSF(24h) THP-1、Jurkat、HL-60、K562、Kasumi-1 等 悬浮细胞做摄取相对难，一方面大多悬浮细胞摄取能力不强，荧光信号弱，另一方面细胞是球形，细胞不伸展、核质间隙太小。建议如下： 摄取时间：建议12～24h。 固定方法：细胞无法固定在玻片上，需要离心收集后固定。 悬浮细胞缺乏贴壁细胞典型的铺展形态和明显的应力纤维结构，一般不建议染细胞骨架。 因此，在常规悬浮细胞外泌体摄取实验中，推荐采用“外泌体荧光标记 + 细胞核染色”的检测方法。 参考图片 Jurkat 摄取时间12h |
