文献解读丨（CELL=66.85）通过冻融脂质体-蛋白质复合物轻松制备脂质体介导的蛋白质递送系统

由于对细胞外RNA (exRNA)分离方法的性能缺乏了解，导致细胞内部和跨研究的重复性差，阻碍了exRNA领域的进展。通过检测评估细胞外囊泡(EV)、核糖核蛋白(RNP)和高密度脂蛋白(HDL)的特异性miRNA，确定每种分离方法对不同exRNA载体亚类的相对效率。

并且，同通过对5种生物液体中的10种分离exRNA的方法系统比较，有助于研究人员为个别研究选择最佳的方法，提高检测的可靠性和可重复性。

文献思路：

对不同类型液体样本进行exRNA分离，miRNA建库测序后进行数据分析

不同种类RNA的分布因生物液体和exRNA分离方法而不同

qRT-PCR鉴定exRNA分离和定量的变异来源

RNA-seq分析显示不同种类RNA的分布因生物液体、供体/细胞系exRNA分离方法而不同

small RNA-Seq中miRNA 的结果之一：miRNA的Complexity与miRNA的测序深度相关

利用miRNA的Complexity、表达量和重复性指标来评估exRNA分离方法的性能

总体思路：对不同类型液体样本进行exRNA分离，miRNA建库测序后进行数据分析

（1）样本

plasma 血浆、serum 血清、urine 尿液：来自10名男性或女性，在Lab5进行收集；

Bile 胆汁：三名疑似患有胆管癌的捐赠者(P1–P3)和一个健康的成人捐赠者(P4)；

细胞培养条件培养基(CCCM)：在三个实验室收集了三种细胞类型

human embryonic stem cells (hESCs, Lab5)；

primary neonatal rat ventricular myocytes (NRVMs, Lab2)；

human cholangiocarcinoma cells (KMBCs, Lab6)。

（2）exRNA分离细节

胆汁（200μL input）：ExoRNeasy, miRNeasy, Exiqon, Ultra, and Millipore；

细胞培养条件培养基 (4 mL input)：ExoRNeasy, Ultra, Millipore, and ExoQuick；

血浆和血清 (500μL input)：ExoRNeasy, miRNeasy, Exiqon；

尿液 (500μL input)：ExoQuick, ExoRNeasy, Homebrew, Millipore, miRNeasy, and Ultracentrifuge。

（3）small RNA文库构建

所有实验均在同一实验室进行。

对于血浆、血清和CCCM，对来自一个实验室的三个重复exRNA分离物和来自其他实验室的一个重复进行了测序；

对于胆汁，分析了四个样本，因为在qRT-PCR实验后，其他两个样本材料不足；对于尿液，所有样本来自合并后的女性和男性，一个女性样本一个男性样本。

不同种类RNA的分布因生物液体

和exRNA分离方法而不同

不同类型的生物液体样本，用不同方法分离得到的exRNA片段分布和产量不同。

RNA大小分布差异表现为：所有血清和血浆样本均表现为双峰分布，在ExoQuick和ExoRNeasy样本中较短(<200nt)占优势，较长(>200nt)RNA在miRNeasy样本中占优势，这两个峰在Exiqon、Nor和Nor_Ami样本中都有很好的表现；

Ultra的结果变化最大，实验室2的样本中RNA大多较短，实验室5的短rna和全长18S和28Srna，实验室6的总产量较差；尿液中，RNA大小分布相似，但不同方法的产量不同，ExoQuick、 Ultra和Millipore的产量低于ExoRNeasy、miRNeasy和Homebrew；

此外，使用RiboGreen (Thermo Fisher)测量exRNA浓度，但结果显示通过生物分析仪、qRT-PCR和小RNA序列清晰检测到的RNA，无法在RiboGreen检测到。因此，研究者不建议使用RiboGreen来定量分离exRNA。

qRT-PCR鉴定exRNA分离

和定量的变异来源

采用三个miRNA，这三个miRNA都曾经在多篇文献中被报道存在于细胞分泌的外泌体中：let-7a-5p，miR-16-5p，miR-223-3p。qRT-PCR数据采用方差分析法进行分析，变异性使用the sum of squares divided by the total error。

检测过程和结果为：胆汁样本，exRNA分离在同一个实验室中进行，差异的最大来源是样本(P1-P4)，其次是exRNA分离方法，三种miRNA之间的变异较低；

尿液样本，exRNA分离在同一个实验室中进行，变异的最大来源是分离方法，其次是生物流体供体的性别，目标miRNA和样本的贡献可以忽略不计；

CCCM样本，其中实验室是变异性的最大来源，其次是靶miRNA、exRNA分离方法和源细胞系；

血清和血浆样本：qRT-PCR数据同时采用两种方法同时进行分析，变异性的最大来源是靶标miRNA，其次是实验室和exRNA的分离方法。

这些结果表明：当检测少量miRNAs的qRT-PCR数据时，exRNA分离方法是除CCCM外的所有生物液体变异的重要来源；

在所有的多实验室实验中，实验室变量对变异性的贡献显著，使用相同的qRT-PCR机器的两个实验室产生了最相似的结果。这一观察结果表明，qRT-PCR过程，而不是exRNA分离过程，可能是实验室间实验室变异的主要来源；

对于CCCM和血清/血浆，靶miRNA也是变异的一个重要来源，这表明检测的三个miRNA可能携带在这些生物液体的不同成分中。

作者统计了不同RNA种类的比对率：rRNA, miRNA, tRNA, piRNA其它基因组序列, 以及未比对上的reads，比较了每种生物液体类型中不同方法中每种RNA种类的百分比。

对于胆汁，Exiqon的%miRNA显著高于所有其他的方法，而P1的%tRNA显著高于P2。RNA种类在所有细胞RNA样本中的分布相似，以rRNA序列为优势；

对于CCCM，Ultra的%tRNA显著低于其他方法，而ExoQuick和Ultra的%miRNA显著高于ExoRNeasy和Millipore；

对于血浆和血清，它们之间的RNA种类分布相似，miRNeasy和Ultra样本的%rRNA显著高于其他方法，ME、Millipore和miRCURY的%miRNA显著低于Exiqon、ExoQuick、ExoRNeasy、miRNeasy，Nor, and Ultra；

对于尿液样本，总体上有很高的%tRNA，其中ExoRNeasy和Ultra方法产生最高（但仍然相当低）的%miRNA。

small RNA-Seq 中miRNA 的结果之一：miRNA的Complexity与miRNA的测序深度相关

作者对small RNA-Seq 中miRNA进行分析发现，miRNA的Complexity与miRNA的测序深度相关。Complexity是指number of miRNAs with >= 10 raw counts。miRNA的Complexity与测序深度(total miRNA read count)正相关。

对于每种生物液体，Complexity会逐渐稳定在一个特定的miRNA测序深度，也即测序饱和度。不同的液体类型，饱和度不一样。

对于胆汁样本，180 miRNAs at 0.9 million total miRNA counts，对于胆汁，只有Exiqon库达到了这个饱和；

对于CCCM样本，250 miRNAs at 0.6 million total miRNA counts；对于血浆样本，400 miRNAs at 2.5 million total miRNA counts；

对于血清样本，350 miRNAs at 2.5 million total miRNA counts；对于尿液样本120 miRNAs at 0.1 million total miRNA count。

利用miRNA的Complexity、表达量和重复性指标来评估exRNA分离方法的性能

为了评估所测试的exRNA分离方法的相对性能，作者对数据进行了归一化和过滤。考虑到文库之间测序深度的差异，然后计算了5个指标：complexity；

mean number of detected miRNAs；

mean percentage of replicates in which a given miRNA was detected；

percent coeffificient of variance (%CV) across replicates；

a combined expression reproducibility score, which we term the integrated quality score (IQS)。

由于检测到的miRNA的数量及其在技术重复中一致表达的概率取决于平均表达水平，因此根据每种生物液体和分离方法的平均miRNA表达水平(以每百万[RPM]miRNA计数表示)展示结果。

对于每种生物液体及分离方法，每个miRNA的IQS是exRNA分离试剂盒的平均表达分位数和%CV分位数的和。在所有对给定miRNA有可测量表达的分离方法中，平均表达分位数和%CV分位数的评分范围为1-5：1为最低平均表达或最高%CV，5为最高平均表达或最低%CV。计算在至少四种方法中具有可测量表达的miRNA的IQS值，因此，对于给定的分离方法，更高的IQS表明更高的表达和更高的重现性，具有更好的分析性能。

通过比较不同exRNA分离方法中IQS值的分布，作者可以很容易地选择最佳的方法来分离目标miRNA列表或为所有miRNA。理想的分离方法上图（G和H）应该有明显的左偏斜，表明具有更高表达和重复性的miRNA比例更高。计算第75百分位IQS(IQS75)作为左偏度的指标，并结合每种分离方法的complexity，可以对每种被测试的exRNA方法的性能进行排序。使用这些指标，血浆和血清的检测结果相似，与其他方法相比，ME、Millipore、miRCURY、miRNeasy和Ultra与其他方法相比显示出明显较低的复杂性。除血浆中的miRCURY试剂盒外，在重复中表达的miRNAs的百分比与平均表达水平呈正相关

这项研究系统性地比较了不同类型的生物液体样本通过不同的分离方法,exRNA的miRNA-seq不同：

测序的复杂性和可重复性因分离方法而异；

不同分离方法对exRNA载体的获取不同；

exRNA分离方法的性能因生物液体和RNA的种类而不同；

miRDaR能够定制选择最佳的exRNA分离方法。

从而为exRNA的分析研究中，提高检测的准确性和重复性而选择定制“最佳分离exRNA方案”提供了指导。