文献解读丨功能化的外泌体平台为恶性黑色素瘤的靶向治疗提供了有前景的策略

黑色素瘤是最恶性的皮肤肿瘤，难以通过化学疗法、生物疗法和免疫疗法的替代疗法治愈。先前研究表明，雷公藤甲素(TP) 对黑色素瘤表现出强大的杀肿瘤活性。然而，TP的临床潜力受到其水溶性差、半衰期短和生物毒性的困扰。

外泌体（Exosomes, Exo）作为药物递送载体具有独特的优势，可针对疾病特点进行合理的修饰，实现药物的靶向递送，进而达到增效减毒的目的。

结果表明：功能化的外泌体平台为恶性黑色素瘤的靶向治疗提供了有前景的策略。

文献思路：

hUCMSCs 的表征及鉴定

EXO，CRGD-EXO和CRGD-EXO/TP的表征

cRGD-Exo/TP的内化机制

细胞的增殖抑制

cRGD-Exo/TP诱导肿瘤细胞凋亡的机制

cRGD-Exo/TP的体内生物分布和药代动力学

体内抗肿瘤功效

CRGD-Exo/TP 的体内生物安全性评价

hUCMSCs 的表征及鉴定

图1

从 hUC 中分离 hUCMSCs (人脐带间充质基质细胞) ，通过流式细胞术分析 hUCMSCs 表面标志物（图1A）；

MSC阴性标志物CD45和CD34（在内皮细胞和造血干细胞中的表达）的阳性率低于1%，而标志物CD90、CD29和CD44的阳性率均在99%以上，表明培养细胞具备 hUCMSCs 的代表性特征（图1B）。 

结果表明：hUCMSCs成功从hUC中提取出来，表现出高度的增殖和自我更新能力。

EXO，CRGD-EXO和CRGD-EXO/TP的表征

图2

采用梯度离心法纯化人脐血间充质干细胞外泌体。然后在60 °C下将外泌体与自组装胶束(DSPE-PEG2000-cRGD)共混制备 cRGD-Exo。然后将TP包埋在 cRGD-Exo 中构建靶向给药系统 cRGD-Exo/TP。CRGD-Exo/TP结构示意图如（图2A）所示；

透射电镜(TEM)及动态光散射检测到 Exo、cRGD-Exo 及 cRGD-Exo/TP 的形态及大小分布（图2B）；

Western blot检测到Exo和cRGD-Exo/TP中特异性标记CD9、CD63和TSG101的表达，表明Exo成功从hUCMSCs中分离出来，且结构cRGD插入和载药的干扰（图 2C）；

使用流式细胞仪检测平均荧光强度 (MFI) ，当Exo与cRGD的质量比为1:1时，MFI最高，明显高于Exo组（图 2D, E）；

通过载药量（DL）和包封率（EE）筛选cRGD-Exo与TP最合适质量比为1:1时，cRGD-Exo/TP的EE和DL值较高（图2F）；

（图2G）显示cRGD-Exo/TP在不同pH释放介质中72 h的药物释放曲线。

结果表明：cRGD-Exo/TP的释放模式使得它是一种潜在的癌症靶向给药系统治疗。

cRGD-Exo/TP的内化机制

图3

A375细胞与PKH26染色的Exo/TP、cRGD-Exo/TP ，HaCaT细胞与PKH26染色 cRGD-Exo/TP共孵育4小时，共聚焦结果显示Exo成功内化到细胞质中（图3A）；

半定量结果表明cRGD-Exo/TP 组的MFI显着高于 Exo/TP 组，且A375 细胞的MFI显着高于HaCaT 细胞（图3B）；

证实了受体介导的cRGD-Exo/TP（αvβ3整合素蛋白）的细胞类型特异性内化（与 A375 细胞相比，αvβ3 整合素蛋白在 HaCaT 细胞上低表达）。在12h时，cRGD-Exo/TP 组的细胞 TP 含量分别是 Exo/TP和TP溶液组的 1.98 倍和 1.56 倍（图3C），这可能是由于 Exo 具有出色的生物相容性和 cRGD，指导 cRGD-Exo/TP 特异性靶向黑色素瘤细胞中的 αvβ3 整合素。用各种抑制剂预处理细胞研究内化机制，表明多种内化途径参与其中(图3D、E)。

细胞的增殖抑制

图4

CCK8结果显示 Exo 和工程化 cRGD-Exo 的细胞毒性可忽略不计，而游离 TP、Exo/TP 和 cRGD-Exo/TP 均抑制细胞增殖，cRGD-Exo/TP 的抑制作用最强（图4A）；

Transwell实验表明 TP 、Exo/TP 和 cRGD-Exo/TP 可显着抑制 A375 细胞侵袭，cRGD-Exo/TP 的抑制效果最强(图4B, C)；

凋亡实验表明TP 、Exo/TP 和 cRGD-Exo/TP促进细胞凋亡，且cRGD-Exo/TP 处理的A375细胞凋亡率最高（图4D, E）；

细胞周期实验结果显示当用TP溶液、Exo/TP或cRGD-Exo/TP处理时，G0 /G1期的细胞群下降，S 期细胞增加 ，表明TP主要阻断细胞周期的S期，从而影响有丝分裂并抑制肿瘤细胞生长（图4F, G）。

上述结果表明：cRGD-Exo/TP 抑制A375细胞增殖和侵袭，促进凋亡，阻断细胞S期。

cRGD-Exo/TP诱导肿瘤细胞凋亡的机制

细胞凋亡与死亡受体依赖性途径（外在途径）和线粒体依赖性途径（内在途径）有关。（图5A） 显示 cRGD-Exo/TP 显着增加 caspase-8 和活化 caspase-3 的表达，这表明外在途径参与了细胞凋亡。此外，Bcl-2家族蛋白包括促凋亡蛋白如Bax和抗凋亡蛋白如Bcl-2。

Bax/Bcl-2 比率的增加可连续触发 cyto c 和 caspase-9 的表达，通过 caspase 级联和线粒体途径导致线粒体功能障碍。

此外，Survivin、VEGF和NF-κB与黑色素瘤的发生、血管生成、增殖、转移、凋亡和耐药性密切相关。survivin、VEGF和NF-κB的表达降低表明 cRGD-Exo/TP通过抑制肿瘤血管生成、细胞增殖和迁移来抑制A375细胞的生长。

TP诱导的细胞凋亡途径示意图。箭头表示促进相关蛋白表达，钝箭头表示抑制(图5B)。 

cRGD-Exo/TP 的体内生物分布和药代动力学

小鼠活体成像结果显示两组小鼠的荧光强度在4 h内稳定增强，随后信号逐渐减弱。此外，DiR-cRGD-Exo/TP能更好地靶向并在肿瘤部位蓄积（图6A）；

cRGD-Exo/TP处理的小鼠肿瘤组织中的荧光信号强于Exo/TP组（图6B）；

两组肿瘤组织中荧光强度随时间的变化，直观地表明cRGD-Exo/TP的保留时间更长，肿瘤靶向性更好(图6C)  ；

TP 包封在 Exo 或 cRGD-Exo 后的半衰期延长可能是由于 Exo 膜阻止了包封的药物不及时泄漏，延迟了在血流中的消除，延长了体内循环时间（图6D）； 

对于靶向分析，随着时间的推移检测肿瘤组织中的 TP 浓度，cRGD-Exo/TP 的肿瘤间 TP 积累更高（图6E）。

结果表明：cRGD-Exo/TP能够更好的靶向肿瘤，且保留时间更长，TP的积累更高。

 体内抗肿瘤功效

图7

动物分组和操作示意图（7A）；

其他组相比，cRGD-Exo/TP组的肿瘤生长受到显着抑制（图7B-D）；

组织病理学检查(H & E，苏木精-伊红染色)显示，在 cRGD-Exo/TP 组中可以显示肿瘤切片的病理特征，如细胞核缩小，局灶性坏死和更多的细胞质（图7E）；

TUNEL实验表明与对照、cRGD-Exo、TP 溶液和 Exo-TP 相比，用 cRGD-Exo-TP 处理后的阳性细胞（凋亡细胞、绿色荧光）显着增加（图7F）；

Ki67(增值指标)染色结果显示cRGD-Exo/TP可以显着抑制肿瘤细胞增殖（图7G）； 

Kaplan-Meier 生存曲线表明，与其他组相比，用 cRGD-Exo/TP 治疗的小鼠的平均生存时间显着延长（图7H）。

结果表明：cRGD-Exo/TP对黑色素瘤具有显着的抑制作用。并且经过治疗的小鼠平均生存时间显着的延长。

CRGD-Exo/TP 的体内生物安全性评价

图8

考虑到 TP 治疗癌症有效且副作用严重，通过监测治疗期间小鼠体重变化、器官指数、正常组织 H&E 染色、血常规来评估 cRGD-Exo/TP 的生物安全性。  

cRGD-Exo/TP和Exo/TP组的小鼠体重缓慢增加，与对照组和cRGD-Exo组没有显着差异。然而，TP溶液组的小鼠体重减轻。但是在 cRGD-Exo/TP 和对照组之间没有观察到器官指数的明显变化（图8A）；

游离TP处理小鼠的肝肾指标明显低于对照小鼠（图8B）；

TP溶液组的心脏、肝脏和肾脏受损，心肌细胞扩张并充血；肝组织出现严重的细胞紊乱、空泡变性、局灶性坏死；肾小球和肾管内皮细胞明显异常肿胀（图8C）；

生物安全性结果再次证实了 cRGD-Exo/TP 的体内生物相容性，这可能有助于肿瘤靶向和在正常组织中的低分布。

作者的本次实验,成功地从hUC 的 hUCMSCs(人脐带间充质基质细胞)中提取出EXO，并用基于αvβ3整合素的 cRGD 进行了工程改造。cRGD-Exo 负载 TP(雷公藤素)，即 cRGD-Exo/TP(仿生靶向药物递送系统 )，可以通过多种内化途径被 A375 细胞吸收。

此外，cRGD-Exo/TP通过扰乱半胱氨酸天冬氨酸酶级联和线粒体通路并改变细胞周期分布，显着抑制体外增殖、侵袭和细胞凋亡促进。此外，体内生物分布和药代动力学表明，cRGD-Exo/TP具有优异的黑色素瘤靶向能力，延长了TP的半衰期。此外，体内抗肿瘤结果表明，cRGD-Exo/TP 显着抑制肿瘤生长并延长荷瘤小鼠的存活时间，且生物毒性可忽略不计。