血液中蛋白质的低稳定性和低细胞膜渗透性，需要合适的载体将蛋白质输送到细胞中。在这里，我们报道了一种将蛋白质包封到脂质体中进行递送的简单一步方法。我们使用带负电荷的超氧化物歧化酶（SOD）和多阳离子脂质体作为蛋白质和脂质体模型。通过冻融SOD-脂质体复合物（lipolexes）制备脂质体包裹的SOD。冻融过程中，脂质体中固定化SOD的数量显著增加。令人惊讶的是，将单层脂质体冷冻-解冻产生了多层脂质体，SOD位于脂质层之间。与未冻融的脂质体相比，冻融后细胞内传递的SOD量显著增加。

技术线路

1.冻融脂质体的制备及表征。

2.SOD在冻融脂质体中的固定化和封装百分比。

3.SOD在脂质体中的定位。

4.细胞的摄取。

5.细胞内定位。

6.小鼠体内成像。

实验结果

1.1冻融脂质体的制备

SOD是一种带负电荷的蛋白质（pI = 5.86）；因此，我们使用带正电荷的聚阳离子脂质体来制备脂质体。脂质体采用带正电荷的聚阳离子脂质:DCP-Deta、DOPE和胆固醇（图1），摩尔比为1：1：1，尺寸为100 nm。图片 2.png

图1

1.2质体的表征

水合脂质体作为脂质体封装的sod的对照，水合脂质体的大小略小，表明水合脂质体中包裹的SOD与内部脂质层结合，然后脂质体大小收缩。

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表1脂质体、SOD-脂质体、冻融SOD-脂质体和水合脂质体的粒径、多分散性指数（PDI）和zeta电位

2.1 SOD在冻融脂质体中的固定化和封装百分比

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图2 超氧化物歧化酶（SOD）在冻融脂质体中的固定化和封装百分比。

(a)SOD的稳定性。将SOD（0.25 mg mL-1）冻融，并测定其活性。这些数据代表了SOD活性与未冻融实验相比的百分比平均值±标准差（n = 4)。

(b)脂质体内固定化SOD的量。每个脂质体经超离心纯化后，然后用Triton-X100溶解，最后用HPLC测定固定化SOD的量。这些数据代表了平均值±标准差(n = 4).显著性差异；***p < 0.001与脂质体， *p <o 0.05 与脂质体， ## p <0.01与hydrated liposome.。

(c) SOD封装百分比。每个脂质体经聚乙二醇处理将脂质体表面的SOD分离，经超离心纯化。将脂质体溶解于Triton-X100中，用HPLC法测定SOD的含量。这些数据代表了平均值±标准差(n = 4).显著性差异；***p < 0.001 与lipoplex,；### p < 0.001与hydrated liposome.。

结论：SOD在冻融处理下是稳定；冻融过程提高了脂质体的固体能力及包封。冻融脂质体是一种有效简单的封装蛋白质的脂质体的方法。

3脂质体与SOD的结构定位

用透视电镜观察Aunp（金纳米颗粒）偶联SOD制备脂质体。结果表明：可能通过冷冻过程中脂质体膜的破坏，解冻过程中随后的重组而发生。

图3脂质体的结构和超氧化物歧化酶（SOD）的定位。

(a)游离脂质体的(b)脂质体和冻融脂质体样品的透射电镜图像。箭头表示金纳米标记的SOD。比例尺代表100纳米。（d-f）脂质体、SOD-脂质体和冻融的脂质体样品的示意图。

4细胞摄取

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图4由脂质体传递的脂质体和超氧化物歧化酶（SOD）的细胞摄取。

(a)脂质体不同剂量的细胞毒性。将结肠26NL-17细胞与各浓度的脂质体在37℃孵育24 h。然后用WST-8法检测活细胞。这些数据代表了平均值±标准差(n = 4).

(b)每个样本的细胞毒性。结肠26NL-17细胞分别与cy5-SOD（1 nM）、Dil-脂质体（3 mM）、SOD-脂质体（脂质体3mMSOD1nM）和冻融脂质体（脂质体3mMSOD1nM）在37 1C下孵育24 h。然后，用WST- 8法检测活细胞。这些数据代表了平均值±标准差(n = 4).（c，d）细胞对脂质体和SOD的摄取。每个样品都用Dil-脂质体和Cy5-SOD制备。将这些样品加入到细胞中，孵育24小时。然后，裂解细胞，测定DiI和Cy5-SOD的荧光强度，测定(c)脂质体和(d) SOD摄取率。这些数据代表了平均值±标准差(n = 4).显著性差异；***p < 0.001与。单独SOD，**p<0.01与单独脂质体，###p<0.001，#p0.05与脂质体。

结果：脂质体在浓度为3 mM时，用WST-8法检测活细胞，显示没有细胞毒性；脂质体表面SOD的存在由于脂质体的高负电荷，抑制了脂质体的负电荷。然而，冻融脂质体的脂质体摄取低于游离脂质体和脂质体，因为冻融过程后脂质体的表面电荷降低，粒径越大会减少细胞的摄取。SOD含量高，不能穿透细胞膜。而在静电排斥力的作用下，脂质体可以有效地将SOD传递到膜内。此外，未冻融脂质体与冻融脂质体比，冻融脂质体细胞对冻融脂质体的SOD摄取增加了两倍。

5细胞内定位

表明脂质体和冻融脂质体都有效地从核内体中逃逸，并且SOD在核内体逃逸后从冻融脂质体中释放到细胞质中。

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图5脂质体、超氧化物歧化酶（SOD）和核内体在细胞内的定位。

C26NL17细胞分别与SOD-脂质体和冻融脂质体在37 ℃下孵育24 h。然后固定细胞，用LysoTraccer（蓝色）染色，用共聚焦激光扫描显微镜观察（绿色，SOD；红色，脂质体；蓝色，核内体）。实验重复两次，每次实验拍摄3张照片。尺寸：10 μm。合并（高倍放大）显示放大图片中的正方形图片。

6小鼠体内成像

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图6尾静脉给药后，Cy5-SOD的体内和体外成像。将聚乙二醇化脂质体（Cy5-SOD剂量，0.2 mg kg 1）经尾静脉注射到BALB/c小鼠体内。

(a)用体内成像系统（异种原IVIS Lumina系统）观察Cy5-SOD的实时体内成像。

（b、c）注射24 h后收集心脏、肺、肝、脾、肾等器官，用体内成像系统观察Cy5-SOD的荧光强度。(b)体外成像和每个器官感兴趣的(c)区域。这些数据代表了平均值±标准差(n = 4)).显著性差异；**p < 0.01，*p < 0.05与。单是SOD。

结论：SOD包裹在冻融脂质体中，阻止其与脂质体分离，显著改变了其生物分布。这些结果表明，蛋白质封装是一个有效的体内传递.

结论

建立一种利用冻融技术将蛋白质包埋成脂质体的一步法简便方法。

在这项研究中。采用带负电荷的SOD和带正电荷的DCP-deda的脂质体分别作为蛋白质和脂质体模型。SOD-脂质体复合物的SOD在冻融后固定能力增加，这是由于SOD封装在多层脂质体中的结果。虽然与非冻融脂质体相比，冻融脂质体的细胞对脂质体的摄取减少，但SOD的传递量显著增加，SOD、脂质体和核内体分别定位于细胞内。在小鼠静脉注射冻融脂质体后，SOD的封装阻止了其脱离血液中的脂质体，导致游离SOD分布与非冻融脂质体的SOD分布不同。