2022年大学医7月，南京学院附属口腔医院王文梅、王翔教授研究团队在国际知名杂志、国际免疫联合会官方会刊Frontiers in Immunology发表研究论文“Antimicrobial effect of extracellular vesicles derived fromhuman oral mucosal epithelial cells on Candida albicans”，报道了人口腔黏膜上皮细胞来源EVs对白色念珠菌的体外和体内抗菌作用。

图片 1.png

摘要

白色念珠菌(C. albicans)是一种共生微生物，定植于健康个体的粘膜表面。宿主或环境的改变可导致白色念珠菌的过度生长和宿主的感染，而且，白色念珠菌感染已被证明是口腔鳞状细胞癌和口腔白斑发生发展的危险因素。

本研究的目的是评估来自人口腔黏膜上皮(Leuk-1)细胞的EV是否能抑制白色念珠菌的生长和侵袭。作者通过光学显微镜、激光扫描共聚焦显微镜、扫描电子显微镜和透射电子显微镜评估Leuk-1-EVs对白色念珠菌的体外疗效。用芽管形成率、菌丝百分率和微集落光密度分析白念珠菌在与Leuk-1细胞和EV共培养模型及抑制EV分泌后的生长情况。建立小鼠口腔念珠菌病模型，舌粘膜下注射Leuk-1-EVs。采用肉眼观察、H&E染色、PAS染色、扫描电镜等方法评价Leuk-1-EVs在体内的抗真菌作用（图示）。

文献思路

1.Leuk-1和Leuk-1-EVs的表征

图片 2.png

作者通过超速离心从Leuk-1细胞培养上清中分离出EVs，并用NTA、透射电子显微镜和蛋白质印迹进行检测。这些数据表明，作者成功的得到Leuk-1-EVs。

2.Leuk-1-EVs抑制白色念珠菌生长

图片 3.png

作者为了评估 Leuk-1-EVs对白色念珠菌的治疗效果，用不同浓度Leuk-1-EVs处理白色念珠菌。与其他组相比，高浓度EVs(120μg/ml和360μg/ml)处理组在12 h时菌丝形成明显减少，24 h和48 h时微集落形成明显减少，360μg/ml组比120μg/ml组抑菌效果更明显，但在2 h时未观察到芽管形成的显著变化，说明Leuk-1-EVs对白色念珠菌的生长具有浓度依赖性。

这些结果表明，Leuk-1-EVs可能通过抑制白色念珠菌生长和菌丝形成发挥抗真菌作用。

3. Leuk-1-EVs诱导白色念珠菌形态学和超微结构的改变

图片 4.png

作者通过共聚焦显微镜显示，用高浓度EVs (120μg/ml 和360 μg/ml)处理后，菌丝壁上出现不规则的突起，图中的白色箭头表示菌丝壁上的突起。结果显示，高浓度处理组菌丝突起明显多于低浓度处理组和对照组。

图片 5.png

作者用扫描电子显微镜下发现，未处理的白色念珠菌壁均匀光滑，实验组发现的孢子较多，菌丝突出更明显。结果还显示，实验组白色念珠菌的孢子和菌丝突出多于对照组，这些具体变化用图中的黑色箭头表示。

结果表明，实验组白色念珠菌的孢子和菌丝突起多于对照组。

图片 6.png

在透射电子显微镜中，未经处理的白色念珠菌细胞壁光滑完整，细胞质均匀，细胞器完整。相比之下，高浓度处理组，白色念珠菌胞浆密度不均匀(图中绿色箭头)、细胞壁上粘液蛋白增加(图中黑色箭头)和细胞壁突出(图中棕色箭头)、细胞壁不完整(图中红色箭头)、细胞膜内卷(图中黄色箭头)、明显肿胀的线粒体、细胞器肿胀和细胞质不均(图中紫色箭头)。作者还分析了两组白色念珠菌细胞壁的平均密度和厚度。结果显示，实验组细胞壁平均IOD(4.37±0.33)显著低于对照组(10.09±0.51)，实验组细胞壁平均厚度(230.76±11.35 nm)显著高于对照组(99.28±7.94 nm) 。

这些结果进一步表明，Leuk-1-EVs可能通过诱导破坏细胞壁完整性和细胞器结构的损伤发挥抗真菌作用。

4. GW4869减弱Leuk-1-EV对白色念珠菌生长的抑制作用

图片 7.png

GW4869是nSMases(也称为SMPD2和SMPD3)的特异性抑制剂，已被证明可以抑制细胞外泌体的释放。作者为了筛选GW4869的最佳浓度，用CCK-8法测定了不同浓度GW4869处理的Leuk-1细胞的存活率，高浓度GW4869(10μM和20μM)处理的细胞活力显著低于其他各组(分别为81.44%和56.70%)。因此，最佳培养浓度设置为7.5μM。作者为了研究EVs释放量降低对Leuk-1细胞抗白色念珠菌活性的影响，作者评估了在与GW4869共培养的Leuk-1细胞后，白色念珠菌生殖管、菌丝和微菌落的形成。作者在抑制Leuk-1细胞外泌体分泌2h后，显微镜下观察白念珠菌的芽管、菌丝(12h)和菌落(24h和48h)的形成。

结果表明，与对照组相比，白色念珠菌+Leuk-1组和白色念珠菌+Leuk-1+GW4869组的胚管形成率显著降低。根据光密度分析结果发现白色念珠菌+Leuk-1+GW4869组菌丝和小菌落的光密度高于白色念珠菌+Leuk-1组。

结果表明，EVs释放的减少会影响Leuk-1对白色念珠菌的抗真菌作用。

5.Leuk-1-EVs 和 Leuk-1 细胞协同抑制白色念珠菌的生长

图片 8.png

在显微镜下观察到Leuk-1细胞和Leuk-1-EVs协同作用下白色念珠菌的胚管、菌丝和微菌落的形成情况，发现白色念珠菌+ Leuk-1组和白色念珠菌+ Leuk-1 + EVs组的胚管形成率显著低于白色念珠菌组，通过菌丝和微菌落光密度分析结果为白色念珠菌+ Leuk-1+ EVs组均低于其他组。

这些结果进一步表明，Leuk-1-EVs可以通过协同抑制白色念珠菌的生长来增加 Leuk-1细胞的抗真菌作用。

6. Leuk-1-EVs治疗可减轻小鼠口腔念珠菌病

图片 9.png

作者构建了口腔念珠菌病小鼠模型，通过对小鼠舌内进行注射Leuk-1-EVs治疗后，白色念珠菌+ EVs组的白色病变评分显著降低。

结果表明，Leuk-1-EVs的治疗可以通过减轻口腔黏膜的白色念珠菌感染而在体内发挥抗真菌作用。

7.Leuk-1-EVs治疗减少白色念珠菌诱导的口腔黏膜炎症

图片 10.png

作者通过口腔黏膜组织病理学H&E染色发现白色念珠菌+EVs组可见正常的丝状乳头，白色念珠菌+ EVs的炎症细胞明显减少，炎症细胞浸润强度明显低于白色念珠菌组，还通过PAS染色结果发现白色念珠菌组舌粘膜中的菌丝比白色念珠菌+EVs组的多且丝状乳头消失。与白色念珠菌组相比，白色念珠菌+EVs组菌丝侵袭程度显着降低。

这些结果表明，通过Leuk-1-EVs的治疗可以减少及抑制白色念珠菌诱导的口腔粘膜炎症和侵袭。

8.Leuk-1-EVs治疗可抑制口腔黏膜白色念珠菌的侵袭

图片 11.png

扫描电子显微镜与PAS染色结果一致，显示白色念珠菌组舌背的白色念珠菌菌丝多于白色念珠菌+EVs组，白色念珠菌组还可以观察到生物膜和角蛋白脱屑。通过菌丝和孢子数量分析还表明，白色念珠菌组明显多于白色念珠菌+EVs组。

结果表明，Leuk-1-EVs治疗可以通过限制白色念珠菌菌丝侵入口腔黏膜来发挥抗真菌作用。

结论

在本文研究中，Leuk-1-EVs不仅抑制了白色念珠菌的生长，而且诱导了白色念珠菌的超微结构改变和损伤。作者的结果还表明，Leuk-1 EVs对口腔念珠菌病小鼠模型具有抗真菌作用，可减轻白色念珠菌的感染和侵袭。深入了解口腔黏膜上皮细胞衍生的EVs与白色念珠菌之间的特异性相互作用，将有助于制定涉及EVs治疗念珠菌病的策略。

文献链接：DOI: 10.3389/fimmu.2022.777613

上一篇文献解读丨通过冻融脂质体-蛋白质复合物轻松制备脂质体介导的蛋下一篇文献解读丨肺特异性外泌体用于非小细胞肺癌中miRNA-126