工程外泌体已成为癌症治疗中流行的药物传递载体。由于外泌体的器官靶向性在全身给药后的器官分布中起着重要作用，使得外泌体作为药物载体变得十分有趣。在这里，作者在文章中证明了乳腺癌细胞(MDA-MB-231)来源的外泌体(231-Exo)可以通过外泌体上过表达的整合素β4和癌细胞上的表面活性剂蛋白C (SPC)之间的特定相互作用被非小细胞肺癌细胞特异性内化。

在体外实验中，231-Exo能够识别血液中的A549细胞并有效地逃脱免疫监控系统。一旦在外泌体载体中装载microRNA分子，所产生的装载有miRNA-126 的工程化外泌体 (miRNA126-231-Exo)便通过中断PTEN/PI3K/AKT信号通路，强烈抑制A549肺癌细胞的增殖和迁移。静脉注射载有miRNA-126的外泌体可使小鼠产生有效的肺归巢效应。当在肺转移模型中进行测试时，miRNA-231-Exo在体内对肺转移的形成起到有效的抑制作用。

总之，文章的数据证明了在将外泌体作为药物载体设计的过程中，利用外泌体的器官靶向性特征的可行性，并在小鼠模型中产生了有效的抗转移作用。

技术示意图

在非小细胞肺癌中使用载有miRNA-126的外泌体(miRNA-231-Exo)的抗癌机制的示意图。

外泌体(已经表达ITGβ4表面标记)用于装载miRNA-126分子。miRNA-231-Exo的器官靶向性特征有助于在肺转移动物模型中的有效靶向作用。作者认为靶向作用是通过SPC⁺ A549肺癌细胞(存在于肺和循环中)和ITGβ4⁺外泌体之间的特异性相互作用介导的。

一旦载有miRNA-126的外泌体被A549细胞内化，便可通过PTEN/PI3K/AKT途径介导的机制实现抗癌作用。

文章思路

1.外泌体的表征鉴定

将从MDA-MB-231组织培养物的上清液中分离和纯化的乳腺癌来源的外泌体称之为231-Exo，并对其进行表征鉴定。

首先使用Malvern Zetasizer测定外泌体大小分布，结果表明231-Exo样品的尺寸范围为30-120nm（图A）。同时用AFM和TEM观察231-Exo样品的超微结构，观察到高度均匀的纳米球形颗粒（图B），包括TEM图片中放大图片中的脂质双层结构(图C)。

在生物学实验之前，通过BCA对总蛋白的含量进行测定，其浓度为116.3μg /mL，同时在流式细胞术测定中分析231-Exo的CD9和CD63表达，结果发现其表达量分别为34.1%和44.2%（图D）。初步表明所提取的囊泡状颗粒为外泌体，并用于后续的实验进行相关功能的验证。

2. 体外评估外泌体的癌细胞摄取效率

据报道，在231-Exo上的整合素 (ITGβ4)和在肺上皮细胞上的肺泡表面蛋白C（SPC）在两者特异性结合的过程中中发挥关键作用(图A)。为探究A549细胞中SPC蛋白的表达量，文章采用了流式细胞术分析进行检测，结果表明：与正常HELF细胞相比，A549细胞中SPC水平高出约3倍(图B，左图)。

同时文章中也进行了细胞摄取对比研究，以评估外泌体在A549细胞和HELF细胞中的内化，通过对外泌体进行绿色荧光标记并用流式细胞仪检测荧光强度，结果表明231-Exo可以在A549细胞中优先被吸收(图B，右图)。为了解ITGβ4的作用，文章还引用结肠癌细胞衍生的29-Exo视作对照，经过流式细胞术实验检测发现其231-Exo 表面的ITGβ4表达比29-Exo高了4倍左右(图C，左图)。

同时文章中也进行了A549细胞对这两种外泌体的摄取进行了对比，根据流式细胞仪检测结果可以看出：相比于结肠癌细胞衍生的29-Exo，231-Exo更加容易被A549细胞进行内化，并且ITGβ4与外泌体的吸收呈正相关(图C，右图)。

为验证SPC是否在231-Exo被A549细胞内化的过程中起到作用，文章中使用抗体干扰实验进行验证，发现无论是加入抗SPC抗体还是抗ITGβ4抗体，经过流式细胞仪检测后发现被A549内化的231-Exo均显著降低，并且这一特性与抗体的体积程正相关（图D，图E）。此外，为判断装载miRNA后对外泌体231-Exo的影响，利用共聚焦和流式细胞实验检测，结果均表明231-Exo在装载miRNA-231前后变化不大。

3. 外泌体对A549细胞的特异性识别和miRNA-231-Exo在血液中的稳定性

为了模拟231-Exo对A549细胞的特异性识别过程，作者用PKH67对231-Exo进行染色，A549细胞用PKH26进行染色，并将两者在血液中一起共孵育，采用流式细胞术进行分析，发现有79.2%的A549细胞含有231-Exo（图A），同时利用，共聚焦显微镜也发现了231-Exo(绿色)仅累积到A549细胞(红色)中，而不是血液中的其他细胞中（图B）。

此外，为观察231-Exo是否被免疫系统识别，文章中特意用流式细胞术测定法检测了231-Exo中的CD47表达，也称为“不要吃我”信号（有助于在生理条件下维持非恶性细胞的免疫耐受性，但这种分子可以帮助不同癌症类型的癌细胞存活），

结果表明：231-Exo中的CD47表达量显著高于对照组（图C）。为了进一步巩固数据，利用共聚焦观察白细胞对231-Exo的摄取，但是实验结果表明：没有观察到明显的外泌体摄取（图D）。这意味着231-Exo可以有效地逃离先天免疫细胞。为进一步检测装载miRNA的外泌体的稳定性，作者使用流式细胞术（图E）和共聚焦显微镜（图F）观察发现在37°C的血液中孵育8小时后，miRNA依旧保持高度完整性，而这促使文章进一步在肺转移动物模型中测试其抗癌效果。

4. miRNA-231-Exo的体外增殖和迁移抑制作用

为了研究miRNA-231-Exo的递送效率，将miRNA-126用FAM进行标记，并转染到231-Exo中，3h后利用共聚焦显微镜(A)或流式细胞术(B)观察miRNA-126-Exo被A549摄取的情况，

结果表明：miRNA-126-Exo能被A549细胞有效吸收。同时文章也检测了miRNA-231-Exo对A549的细胞毒性， MTT和流式细胞术测定结果表明：A549细胞会受到来源于miRNA-231-Exo的细胞毒性受损，并且空的231-Exo也产生了中等程度的细胞毒性(图5C和D)。

为了评估miRNA-231-Exo对A549细胞迁移的影响，进行了transwell试验(图5E)，结果表明：miRNA-231-Exo处理细胞的迁移率低于对照组(图5E)。为了检测miRNA-231-Exo在PTEN/PI3K/AKT信号通路上的影响，进行了WB实验和qPCR实验以分析以观察关键蛋白因子，WB和qPCR结果表明：miRNA-231-Exo导致PTEN水平增加(图5F)。

总的来说，231-Exo可以用作天然靶向载体，将miRNA-126递送至A549细胞，通过PTEN/PI3K/AKT信号通路导致增殖和迁移抑制。

5. miRNA-231-Exo的体内抗转移作用

为评估在肺转移模型中miRNA-231-Exo的体内抗癌治疗效果。将A549细胞静脉注射到裸鼠体内。从第三天起，每3天通过尾静脉注射miRNA-231-Exo至小鼠体内，共注射7次。

每三天测量一次小鼠的体重。实验结束时采集动物肺，量化转移灶数量，结果表明：miRNA-231-Exo治疗组有效地减少了肺转移病变的数量，而免疫组化分析也证实了这一点（图A-C）。

如图6D所示，在体重测量上没有明显差异。这表明miRNA-231-Exo纳米载体具有生物相容性。

结论

文章证明了ITGβ4⁺乳腺癌细胞衍生的外泌体可以作为天然靶向纳米载体用于体外和体内保护性miRNA-126递送。

这些外泌体被SPC+肺癌细胞大量内化，例如A549细胞。负载miRNA-126的231-Exo通过调控PTEN/PI3K/AKT通路相关因子有效地抑制肺癌细胞增殖和迁移效率。除此之外，载有miRNA-126的231-Exo还可以从先天免疫细胞中有效逃逸，并在在小鼠肺癌转移模型中显示出有效的癌症抑制效率。