Front Immunol | 天津医科大学眼科医院魏瑞华/粘红: MSC衍生的小细胞外囊泡减轻自身免疫性泪囊炎

间充质干细胞衍生的小细胞外囊泡（MSC-sEVs）已越来越多地被证明是对抗某些自身免疫性疾病的有前途的免疫调节剂。然而，很少研究MSC-sEVs在自身免疫性干眼症中的可能作用和潜在机制。

作者研究了hUC-MSC-sEVs在兔Sjögren综合征（SS）相关干眼症模型中的保护作用，并探讨了其免疫调节机制，特别是其对巨噬细胞极化的作用。发现hUC-MSC-sEVs给药有效地缓解了兔自身免疫性泪腺炎的发展，并且hUC-MSC-sEVs可以在体内和体外诱导M2巨噬细胞极化并增加Tregs的比例。

此外，hUC-MSC-sEVs 诱导的巨噬细胞能够抑制CD4+ T细胞的增殖并促进Tregs的产生，并且包裹在 hUC-MSC-sEVs中的miR-100-5p对hUC-MSC的调节有很大贡献。这项研究为MSC-sEVs作为一种有前途的Sjögren综合征相关干眼症治疗方法的应用提供了新的思路。

研究背景

Sjögren综合征（SS）相关干眼症是一种顽固的自身免疫性疾病，其特征是泪腺 (LG) 的淋巴和髓细胞浸润以及随后的组织损伤，临床表现为眼部不适甚至视力丧失。尽管SS的病因尚不明确，但现有证据表明，巨噬细胞在SS相关干眼症的炎症发作和消退期间都发挥着重要作用。

为了响应环境信号，巨噬细胞可以分化为经典的促炎M1表型或替代的抗炎M2表型。不平衡的M1/M2极化现在被认为在慢性炎症和自身免疫性疾病的发病机制中至关重要。作者团队之前已经证明了兔自身免疫性泪腺炎中存在缺陷的M2巨噬细胞活化，这是一种与人类 SS干眼症非常相似的动物模型，表明M2巨噬细胞在SS干眼症中的有益作用。此外，M2 巨噬细胞可被视为先天免疫中的一种调节细胞，并且在诱导具有免疫抑制作用的调节性T细胞(Tregs) 方面具有重要意义。

来自临床前研究的累积数据表明，间充质干细胞 (MSC) 的有益作用主要归因于含有小细胞外囊泡 (sEV) 的旁分泌，而MSC-sEV最近已被证明可有效治疗各种炎症和自身免疫性疾病，例如结肠炎和类风湿性关节炎。可以在转录后水平调节基因表达的MicroRNA (miRNA) 构成MSC-sEV的重要组成部分，并且在MSC-sEV介导的免疫抑制作用中至关重要。

最近的研究表明，MSC-sEV可以通过转移miRNA来调节包括巨噬细胞和T细胞在内的免疫细胞的生物活性。然而，目前来自hUC-MSCs (hUC-MSC-sEVs) 的sEVs在SS干眼症中的作用和潜在机制仍然未知。

文献思路：

hUC-MSCs和hUC-MSC-sEVs的表征鉴定

hUC-MSC-sEVs给药有效预防兔自身免疫性

泪腺炎的发展

hUC-MSC-sEVs促进了M2极化并诱导体内Treg生成

发育期给药的hUC-MSC-sEVs对兔自身免疫性泪腺炎有治疗作用

hUC-MSC-sEVs 在体外调节M2巨噬细胞极化

和Treg细胞分化

hUC-MSC-sEVs将炎性巨噬细胞转化为M2表型，

从而抑制T细胞增殖并增加Tregs

由hUC-MSC-sEVs转移的miR-100-5p影响

巨噬细胞表型和功能

分离培养的hUC-MSCs对 CD29、CD44、CD105、CD73、CD90 呈阳性，对 CD45、CD34、CD11b 和 MHC II 类抗原 (HLA-DR) 呈阴性（图 A）。

并且能够分化成脂肪细胞、成骨细胞和体外培养下的软骨细胞（图 B）。

通过连续差速离心加超速离心法从hUC-MSCs的条件培养基中纯化得到hUC-MSC-sEVs。TEM检测显示 hUC-MSC-sEV 呈圆形或椭圆形，呈杯形，具有双层膜结构（图 C）。

NTA证明这些颗粒的直径主要在50-150 nm 范围内，峰值在113 nm附近（图 D）。

WB结果进一步证实这些纳米囊泡对特定标记物呈阳性：CD81、CD9、CD63和TSG101，对非sEV标记物Calnexin呈阴性（图 E）。

兔自身免疫性干眼模型通常在过继转移激活的PBL后的第二周出现明显的临床症状。为了研究 hUC-MSC-sEVs 是否对家兔自身免疫性泪腺炎有预防作用，在过继转移后的早期（第 1、3、5、7 和 9 天）将 hUC-MSC-sEVs 或 PBS 结膜下注射到家兔体内（图A)，并观察临床体征直至第八周。

早在转移后2周，hUC-MSC-sEVs 给药就减轻了疾病的严重程度。与未治疗组相比，hUC-MSC-sEVs 组在观察到的所有时间点均表现出较轻的角膜上皮损伤、更多的泪液分泌和更长的泪液 BUT（图B-E）。

为了进一步验证hUC-MSC-sEVs的效果，在转移后第8周进行了组织学检查。如图F-G 所示，与未使用 hUC-MSC-sEVs 的组相比，hUC-MSC-sEVs组兔的泪腺（LGs）和结膜中观察到炎症细胞浸润较少，组织损伤较少。

总之，这些研究结果表明，在疾病早期施用的hUC-MSC-sEV可有效减轻诱导兔干眼模型的临床严重程度并减少泪道和结膜炎症。

巨噬细胞是LG炎症的重要调节因子。为了阐明hUC-MSC-sEVs如何预防兔自身免疫性泪腺炎的潜在机制，研究了hUC-MSC-sEVs对炎症LG中积累的巨噬细胞的影响。免疫荧光测定显示，用 hUC-MSC-sEVs治疗的模型兔的LGs的静脉周围/导管周围区域CD68（典型的泛巨噬细胞标记物）的表达，低于未治疗组（图 A）。

众所周知，巨噬细胞表现出响应微环境变化在M1和M2之间切换的能力。因此，研究了hUC-MSC-sEVs 是否可以调节巨噬细胞极化。从有或没有给予 hUC-MSC-sEVs 的兔子收集的LGs用于Q-PCR和WB。

如图 B 所示，与未处理组相比，hUC-MSC-sEVs治疗组的LGs中，M1标志物NOS2、IRF5、TNF-α、IL-1β 和 IL-6 基因表达显着降低，而M2标志物如Arg1、CD206、KLF4、IL-10 和 TGF-β基因表达显着升高。

一致地，WB结果显示，hUC-MSC-sEVs 给药导致Arg-1蛋白水平显着增加，LGs中NOS2蛋白表达显着降低（图 C）。

总的来说，这些发现表明，hUC-MSC-sEVs 可以将巨噬细胞转化为抗炎M2表型，以响应LG中的慢性炎症。这些 M2 样巨噬细胞可能通过分泌抗炎细胞因子和促进组织修复来缓解自身免疫性泪腺炎。

考虑到 Tregs 在预防泪腺自身免疫中的关键作用，接下来检测了hUC-MSC-sEVs对Tregs 的影响。Treg 包含由X连锁转录因子Foxp3指定的独特抗炎谱系，可直接由Nurr1调节。作者观察到，在hUC-MSC-sEVs给药后，Foxp3和Nurr1的mRNA表达以及炎症LGs中 CD4+Foxp3+Tregs的比例显着升高（图D，E）。

总之，这些数据表明，hUC-MSC-sEVs 给药促进了兔自身免疫性泪腺炎中的Treg诱导。

为了观察 hUC-MSC-sEVs 在体内的治疗效果，在疾病的发展阶段（诱导后2周）每两天注射一次 hUC-MSC-sEVs 或PBS（共5剂）对模型兔进行治疗。(图 A)。

如图B-E 所示，在第一次注射hUC-MSC-sEV后2周观察到临床症状的缓解。与未治疗组相比，用 hUC-MSC-sEVs 治疗减少了角膜上皮损伤，从第4周到第8周明显增加了BUT，在第6周和第8周时，兔房水泪液量显着增加。

组织学上，通过 hUC-MSC-sEVs 给药，模型兔的LG和结膜中的免疫细胞浸润减少（图 F，G）。正如预期的那样，这些结果表明，在疾病发展阶段施用的hUC-MSC-sEV减轻了兔自身免疫性泪腺炎的严重程度。

接下来研究hUC-MSC-sEVs在体外对M2巨噬细胞极化和Treg细胞分化的调节作用。用或不用 hUC-MSC-sEV (5 μg/ml) 处理来自用辐照pLGEC刺激的模型兔的PBMC。

首先，观察到与对照组相比，hUC-MSC-sEVs组的M1标志物（NOS2、TNF-α、IL-1β 和 IL-6）的转录水平明显降低，而M2标志物（Arg1、CD206、KLF4、IL-10 和 TGF-β）显着增加，这与NOS2和Arg1的蛋白表达一致（图 A、B）。

然后评估了hUC-MSC-sEVs对Tregs的影响。Q-PCR分析显示，hUC-MSC-sEVs组中Foxp3和Nurr1的表达明显高于对照组（图 C）。

共培养5天后收集的PBMC的流式细胞术分析表明，hUC-MSC-sEVs治疗显着增加了 CD4+Foxp3+Tregs的百分比（图 D）。

总之，这些数据表明，hUC-MSC-sEVs 可以诱导 M2 极化并促进受刺激的PBMC中的Treg生成。

鉴于巨噬细胞在先天免疫和适应性免疫中的重要作用，接下来关注 hUC-MSC-sEVs 对巨噬细胞的影响。在共聚焦激光扫描显微镜下，观察到 PKH26（红色）标记的 hUC-MSC-sEV 在共孵育6小时后被内化到PMA处理的THP-1细胞（称为Mac）中并定位于细胞质中（图 A）。 

为了进一步验证 hUC-MSC-sEVs 对巨噬细胞表型的作用，LPS+IFN-γ 刺激的Mac与或不与hUC-MSC-sEVs共培养48小时。通过Q-PCR 和WB分析检测M1和M2标志物的水平。结果表明，hUC-MSC-sEVs 可以在体外有效地诱导人M1 巨噬细胞进入抗炎M2状态（图 B、C）。

先前的研究表明，MSC-sEV 需要其他介质细胞，例如单核细胞来促进Treg扩增，而抗炎巨噬细胞可以诱导Treg。因此，需检测由hUC-MSC-sEV培养的巨噬细胞是否影响T细胞增殖和Treg 分化。如上所述与 hUC-MSC-sEV 孵育后，从各组中分离出Mac和LPS+IFN-γ刺激的Mac，并在抗CD3/-CD28抗体存在下与人外周血来源的CD4+ T 细胞共培养5天。BrdU增殖试验显示CD4+ T细胞增殖被hUC-MSC-sEVs孵育的巨噬细胞显着抑制，尤其是那些用 LPS+IFN-γ 预刺激的巨噬细胞（图 D）。

此外，流式细胞仪分析显示，与其他组相比，hUC-MSC-sEVs孵育的巨噬细胞（LPS+IFN-γ 预刺激）显着提高了CD4+Foxp3+Tregs 的比例（图 E）。这些综合研究结果表明，hUC-MSC-sEVs孵育的具有M2样表型的巨噬细胞可以抑制CD4+ T增殖并增加Treg生成。

图7

图S4

为了深入研究hUC-MSC-sEVs对巨噬细胞的免疫调节作用，通过分析hUC-MSC-sEVs的miRNA测序结果，选择了miR-100-5p进行下一步实验。Q-PCR测定并证实miR-100-5p在分离的hUC-MSC-sEV中显着高表达（图 7A）。

为了进一步证实miR-100-5p在hUC-MSC-sEVs中的作用，从转染了 miR-100-5p inhibitor、NC inhibitor、miR-100-5p mimics或 NC mimics的hUC-MSCs的条件培养基中纯化的sEV。miR-100-5p inhibitor-sEVs、NC inhibitor-sEVs、miR-100-5p mimics-sEVs或NC mimics-sEVs与巨噬细胞共培养。观察到FAM（绿色）标记的miR-100-5p inhibitor包含在 PKH26（红色）标记的sEV中，在共孵育6小时后内化到巨噬细胞（图 7B）。

进一步分析显示，与 NC inhibitor-sEVs 相比，miR-100-5p inhibitor-sEVs 在抑制M1标志物表达和增强M2标志物表达方面效果较差（图 7C-E），表明抑制miR-100-5p在hUC-MSC-sEV减弱了它们对M2巨噬细胞极化的影响。

此外，与NC mimics-sEV 相比，miR-100-5p mimics-sEV 显着上调M2标志物表达并下调M1标志物表达（图S4A, B）。这些结果共同支持了miR-100-5p参与了hUC-MSC-sEVs介导的M2巨噬细胞极化的观点。

接下来，探讨了hUC-MSC-sEVs中的miR-100-5p是否会影响受hUC-MSC-sEVs孵育的巨噬细胞对T细胞的功能。为此，收集用miR-100-5p inhibitor-sEV或NC inhibitor-sEV预处理的THP-1衍生巨噬细胞，然后与人CD4+ T细胞共培养。BrdU增殖试验表明CD4+ T细胞增殖受到NC inhibitor-sEVs孵育的巨噬细胞的显着抑制，而不是miR-100-5p inhibitor-sEVs 孵育的巨噬细胞；同样，与miR-100-5p inhibitor-sEVs孵育的巨噬细胞共培养的CD4+ T细胞中CD25+Foxp3+Treg群体的百分比显着低于与NC inhibitor-sEVs组（图7G），而 miR-100-5p mimics-sEVs孵育的巨噬细胞中CD4+Foxp3+Treg种群的百分比明显上调（图 S4C）。

这些结果表明hUC-MSC-sEVs中的miR-100-5p至少部分负责由hUC-MSC-sEVs孵育的巨噬细胞诱导的T细胞抑制和Treg细胞扩增。

这些研究表明，hUC-MSC-sEVs给药通过使巨噬细胞偏向M2表型和增加Treg比例来减轻兔自身免疫性泪腺炎。

值得注意的是，sEVs-miR-100-5p在hUC-MSC-sEVs的免疫调节功能中发挥着关键作用，尤其是对最终具有T细胞免疫抑制特性的巨噬细胞。

这些结果表明，hUC-MSC-sEV可能为预防和治疗自身免疫性干眼症提供潜在的治疗策略。