尽管几种人工纳米疗法已被批准用于转移性乳腺癌的实际治疗，但它们的低效治疗效果、严重的不良反应和高成本的大规模生产仍然是至关重要的挑战。在此，作者开发了一种替代策略，通过使用茶花中的天然纳米载体 (TFEN) 来特异性触发乳腺肿瘤的细胞凋亡并抑制其肺转移。这些纳米载体具有合适的粒径（131 nm）、外泌体样形态和负 Zeta 电位。此外，TFENs 被发现含有大量的多酚、类黄酮、功能性蛋白质和脂质。细胞实验表明，由于刺激活性氧 (ROS)数量增加，TFENs对癌细胞表现出强烈的细胞毒性。细胞内ROS含量的增加不仅能触发线粒体损伤，还能阻滞细胞周期，从而对乳腺癌细胞产生体外抗增殖、抗迁移、抗侵袭活性。进一步的小鼠研究表明，静脉注射或口服给药后的 TFEN 可在乳腺肿瘤和肺转移部位蓄积，抑制乳腺癌的生长和转移，并调节肠道微生物群。本研究为通过静脉和口服途径抑制乳腺癌及其肺转移的天然类外泌体纳米平台的绿色生产带来了新的见解。

技术路线

TFENs生产过程的示意图及其对转移性乳腺癌的序贯治疗。

(A) TFENs的提取和纯化示意图。(B) TFENs的运输和治疗功能方案，包括i.v.注射和口服给药后TFENs的运输，增加氧化应激，线粒体损伤，细胞周期停滞和细胞凋亡。

文献思路

TFENs的物理化学表征

癌细胞和GIT组织对TFENs的摄取情况

TFENs的体外抗增殖、促凋亡和抗迁移活性

TFENs的抗癌机制

TFENs的体内抗乳腺癌作用

TFENs对肺转移的体内抑制作用

生物安全评估

TFENs的物理化学表征

使用差速离心法结合蔗糖密度梯度超速离心法从新鲜茶花中分离纯化TFENs，透射电子显微镜（TEM）用于观察 TFEN 的形态。很明显，这些 NPs 是球形外泌体样纳米囊泡，平均直径为 20 nm（图1-B）。动态光散射 (DLS, Malvern, Worcestershire, UK) 检测显示 TFEN 的平均流体动力学粒径为 131 nm，具有相对较低的多分散指数 (PDI, 0.155)（图1-C），脂质组学结果显示，磷脂酰胆碱 (PC, 26.6%)、甘油三酯 (TG, 23.4%) 和磷脂酰乙醇胺 (PE, 15.2%) 是 TFENs 的主要脂质成分。此外，分析了总蛋白，包括跨膜蛋白和细胞内蛋白。蛋白质凝胶染色结果表明，TFENs中所有蛋白质的分子量均超过15 kDa（图1-E)。通过蛋白质组学分析进一步分析了这些蛋白质成分，液相色谱-串联质谱法在TFENs中发现了745种蛋白质（图1-F）。通过生物信息学分析发现，发现 16 种蛋白质具有氧化相关功能，表明这些 NPs 可能诱导细胞内氧化应激的增加。通过高效液相色谱-质谱法进行量化，发现在TFENs中存在大量与信号通路、基因表达过程和细胞代谢，包括细胞凋亡、迁移和免疫反应相关的磷脂酰胆碱、甘油三酯、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、双半乳糖基二酰基甘油等物质（图1-G，图1-H）。总的来说，TFENs 可以被认为是天然的载药纳米囊泡，在不加载额外药物的情况下，在癌症治疗中具有广阔的潜力。

癌细胞和GIT组织对TFENs的摄取情况

为验证癌症细胞对TFENs的摄取情况，使用绿色荧光探针 (DiO) 标记 TFEN 并跟踪它们的生物分布。MCF-7细胞对DiO标记的TFENs的细胞摄取百分比（图 2A) 和 4T1 细胞 (图 2B) 随着孵育时间的延长而增加。共孵育5小时后，MCF-7细胞（人乳腺癌细胞）和4T1细胞（小鼠乳腺癌细胞）对DiO标记的TFENs的细胞内化百分比分别为94.4%和49.9%，表明TFENs更优先被这些细胞内化。平均荧光强度 (MFI) 值 (图 2A 和 B) 与这些结果非常一致。以前的研究表明，NPs 的吞噬效率取决于细胞表面的受体。因此，TFENs 内化效率的差异可能是由于MCF-7细胞和4T1细胞之间的异质表面含量所致。图2C显示DiO标记的TFENs（绿色荧光）明显被MCF-7细胞和4T1细胞内化，这些NPs主要分布在细胞核周围（图2-D)。进一步的体内实验表明，口服 DiO 标记的 TFENs（5mg/kg）后，在空肠、回肠和结肠的粘膜中观察到NPs（绿色），这意味着 TFENs 可以有效地穿透肠上皮层和被血液吸收（图 2E）。

TFENs的体外抗增殖、促凋亡和抗迁移活性

首先通过MTT对TFENs抗癌活性进行了评估，在不同时间段（24、48 和 72 小时）将TFENs共孵育后对 MCF-7 细胞、4T1 细胞、A549 细胞和 HeLa 细胞显示出明显的抗癌能力，这些抗癌谱均呈现出两种剂量-依赖和时间依赖的方式（图3-A），而对最大半数抑制浓度测量发现TFENs 对乳腺癌细胞系（MCF-7 细胞和 4T1 细胞）的抗增殖能力比A549细胞和HeLa细胞更强。此外，在72 h的时间点，TFENs对HUVEC细胞和HEK293T细胞的IC50值比对MCF-7细胞和4T1细胞的IC50值高几十到几百，证实了TFEN具有优异的广谱抗肿瘤活性，为了验证TFENs对乳腺癌的促细胞凋亡潜力，进行了细胞凋亡试验，如图 3C，MCF-7和4T1细胞对照组中很少有细胞处于凋亡状态。相反，在与TFENs孵育不同时间段（4和8小时）后，在 MCF-7 细胞和 4T1 细胞中都发现了显着比例的凋亡细胞。作者还发现，在培养8小时后的细胞组中发现的凋亡细胞百分比（69.9%的MCF-7细胞和29.9%的4T1细胞）比培养4小时后的细胞组（35.2%的MCF-7细胞和19.7%的4T1细胞）更高。反映了TFEN的时间依赖性促凋亡作用（早期凋亡加晚期凋亡）。细胞划痕和Transwell实验研究了TFENs的细胞运动抑制能力，图 3C和D表示在对照组中广泛观察到迁移和侵袭的细胞，表明乳腺癌细胞具有内在的转移活性。通过统计学对抗迁移和抗侵袭进行分析，结果证实了TFENs的抗迁移和抗侵袭特性（图3-F和G），表明这些NPs具有很强的抑制乳腺癌转移的能力。而图3-H则表明TFENs对健康细胞和癌细胞的总体影响。

TFENs的抗癌机制

为评估TFEN处理的细胞的细胞内氧化元素。分别使用DCFH-DA和DHE跟踪细胞内ROS和超氧阴离子(SA)的水平。在用TFENs处理后，MCF-7细胞和4T1细胞中的总ROS和SA均显着增加。通过免疫荧光计数发现，与TFEN处理的4T1细胞相比，在TFEN处理的MCF-7细胞中发现了更多的ROS、SA和NO（图4-A）。由于氧化应激可能引发线粒体损伤和细胞周期停滞，文章评估了TFENs在这两个方面的影响。JC-1 作为线粒体膜电位荧光探针，可用于观察凋亡细胞。与JC-1探针孵育后，阴性对照MCF-7 细胞和4T1细胞由于活细胞中的高线粒体膜电位而显示出强烈的黄色荧光强度（J-聚集体）（图4-B），同时发现Cappase 信号通路依赖性细胞凋亡中的Cappase3在FENs 处理24和48小时后MCF-7细胞和4T1细胞中表现为上调，而凋亡抑制蛋白Bcl2表现为下调，观察结果表明，TFEN 的促细胞凋亡是基于Caspase依赖性途径。同时发现TFEN 处理在MCF-7（图-4D）和4T1细胞（图-4E）中诱导了不同模式的细胞周期停滞。与对照MCF-7细胞相比，TFEN处理的MCF-7细胞在G0/G1期和S期的比例显着降低。此外，随着孵育时间的延长，发现更多的MCF-7细胞处于G2/M期，这表明TFENs 可以有效地抑制 MCF-7 细胞的有丝分裂过程。在4T1细胞中，TFENs的处理诱导细胞周期停滞在S期，证明TFENs能够阻断4T1细胞中的DNA复制。许多周期蛋白对细胞周期的进程至关重要，因此评估了两种典型的细胞周期调节蛋白（细胞周期蛋白A和细胞周期蛋白B）的表达谱。图4F显示，与相应的对照细胞相比，在TFENs处理24和48小时后，MCF-7细胞和4T1细胞的Cyclin A和Cyclin B表达水平呈时间依赖性降低，导致细胞周期停滞和随后的细胞凋亡。因此，文章得出结论：TFENs对肿瘤细胞的选择性细胞毒性源于在这些细胞中诱导高氧化压力，而不是在健康细胞中。

TFENs的体内抗乳腺癌作用

为了研究TFENs的体内分布，将 DiR 分子封装到 TFENs 中，并通过静脉注射（i.v.）和口服（oral）两种形式对小鼠进行处理。肿瘤组织中TFENs的最大蓄积量出现在iv注射后24 h的时间点。然而，在口服给药后48小时才观察到这种现象。。接下来，研究了 TFEN 在五个主要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏）中的分布情况。静脉注射和口服给药后，在肝脏和肺中检测到大量TFENs，但在给药24 h后，它们在这两个器官中的荧光信号迅速衰减。值得注意的是，TFENs的第二优先积累部位是肺，这是转移性乳腺癌最常见的转移部位之一。因此，推测TFENs可能具有抑制乳腺癌肺转移的潜力（图5-A）。通过静脉注射和口服两种浓度TFENs治疗后9天内小鼠体重、肿瘤体积、肿瘤重量等数据进行统计分析，发现TFEN处理组体重明显下降（iv，高），与第0天相比，第9天明显下降至81.4%（图5-B）；对照组的肿瘤大小在9天内迅速发展，而TFENs显着延缓了肿瘤的生长趋势（图5-C）；TFEN 治疗组（iv，高）的平均肿瘤重量为 117.6 mg，比其他治疗组轻得多（图5-D）。同时，对不同小鼠组的肿瘤组织切片进行了H&E、TUNEL和Ki67染色，结果表明所有TFEN治疗组与对照组相比，肿瘤细胞数量明显减少，对照组在其肿瘤组织中没有表现出明显的细胞凋亡，而在所有TFEN处理组中凋亡细胞的百分比均显着升高，Ki67阳性肿瘤细胞的数量与TUNEL染色结果呈负相关，证实了高剂量TFENs具有强肿瘤抑制能力。

TFENs对肺转移的体内抑制作用

对于两种给药方法（静脉注射和口服途径），在转移性乳腺癌的肺中均发现了最强的信号和最长的保留时间。此外，静脉注射和口服给药的TFENs在肺中的最大蓄积量分别在12和24小时的时间点达到（图6-A）。此外为研究 TFENs 的抗肺转移作用，静脉注射4T1细胞后，用TFENs治疗肺转移部位的小鼠。虽然所有小鼠组的体重减轻没有统计学意义，但TFEN治疗组（iv，高）的体重最低（图 6-B）。正如预期的那样，所有 TFEN 治疗组的肺组织内肿瘤结节数量均显着减少（图 6-C）。此外，通过以高剂量静脉注射TFENs获得了最强的抗肺转移作用（91.4％抑制率）(图6-D)。对肺组织进行 H&E 染色以确认TFENs的治疗效果，发现在对照组中观察到大量转移性病变，而在TFEN治疗组（iv，高）和TFEN治疗组（口服，高）的肺组织内仅发现散发性病变（图 6E）。文章还对小鼠的粪便进行了微生物分析，实验结果表明：口服途径治疗TFEN可以大大增加胃肠道微生物群的群落丰度和多样性（图6-F），维持肠道菌群的稳定性（图6-G），维持典型有益共生细菌的丰度（图6-I-L）, 并减少典型有害细菌的丰度 (图6-I)，并且TFEN治疗组(iv，高)和TFEN治疗组(口服，高)实现了相当的死亡率降低和存活率提高(图6-M)。这些结果可以归因于TFENs可以对癌细胞的增殖、凋亡和迁移产生直接影响，并调节肠道菌群的平衡。

生物安全评估

为了评估 TFENs 的药理毒理特性，作者分析了TFEN治疗小鼠的生理生化参数的变化，实验结果表明：被治疗后的小鼠在体重和炎症因子的表达量方面均没有显著性的差异（图7-A和B），但是被治疗组小鼠的肝脏和脾脏更重（图7-C），免疫系统中的补体C3分子在被治疗的小鼠（iv，高）体内显著上调，证明TFENs可以在静脉注射后激活补体系统。此外，文章还检查了肝肾毒性，实验结果表明：TFEN治疗组（iv，高）血液中丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）的浓度显着高于对照组和TFEN治疗组（口服，高），揭示了静脉注射TFENs后的潜在肝毒性（图7-G）,但所有与肝肾毒性相关的血液参数在各个处理组之间均无差异性（图7-E-I）且对小鼠主要器官也没有明显的损伤（图7-J）。总体而言，静脉注射 TFENs 可以刺激免疫系统的激活，诱导肝肾毒性，而通过口服途径重复给药TFENs似乎对生物体相对安全。

综述结论