还在为外泌体亚型分离而烦恼吗？来试试 "?"+免疫磁珠法帮你解决“泌”不可分。

    今天就来给大家普及一下外泌体研究中的第一步：如何高效分离和富集外泌体。

    超速离心法是目前最常用的外泌体纯化手段，通过高速离心将大小相同的囊泡从样本中沉淀并纯化出来。外泌体超速离心一般和蔗糖密度梯度离心或蔗糖衬垫组合起来分离低丰度外泌体。需在离心机中以100,000-200,000 x g离心沉淀（含有外泌体）120分钟，使样品中的外泌体在1.13-1.19g/mL的蔗糖密度范围内进行富集。

    尽管这种联合的方法可以获得高度纯化的外泌体，但也存在一些缺点。例如同批次最多只能同时处理6个样本（转子限制）且回收率不稳定，前期需要准备大量材料且外泌体得率低。最重要的是重复离心很可能对外泌体的囊泡造成损害从而降低其质量，并且一些可溶性蛋白可与外泌体形成团块而产生污染。

    聚乙二醇（PEG）可与疏水性蛋白和脂质分子结合共沉淀，早期应用于从血清等样本中收集病毒，现在也被用来沉淀外泌体，其原理可能与竞争性结合游离水分子有关。在4℃利用PEG孵育后通过过滤或离心即可沉淀、回收外泌体。

    采用此种分离方法也存在不少问题：纯度和回收率低，杂蛋白较多（假阳性），颗粒大小不均一，产生难以去除的聚合物，机械力或者吐温-20等化学添加物将会破坏外泌体等，因此发表文章时易受质疑。

    超滤离心法是利用不同截留相对分子质量(MWCO)的超滤膜进行选择性分离，小分子物质会被过滤到膜的另一侧，而大于膜孔径的高相对分子质量物质则截留在超滤膜上。

    这种方法比较简单高效，也不影响外泌体的生物活性，但缺点是外泌体可能会阻塞过滤孔，导致膜的寿命减短，分离效率较低。此外，截留在膜上的外泌体间也会发生粘附，导致产量降低。

    Tips：外泌体是直径30~100 nm囊状小体，大于一般蛋白质。采用此方法需要考虑到与外泌体大小相似的其他囊泡的干扰。

    尺寸排阻色谱法（SEC）被认为是从不同样本中分离和纯化细胞外囊泡（EVs）的最佳方法之一，因为它能够快速而有效地将EVs从复杂样本中分离出来，并能保持EVs的原始形状和生物学功能。

    主要是根据分子大小不同，行走路径不一样，从柱子流下来有时间差而进行分离。其中分子大小与外泌体接近的物质会一起流出，导致外泌体不纯。

    免疫亲和是利用抗体和 EVs表面蛋白之间的相互作用来分离EVs。常见的方法包括：流式法、磁珠法、试剂盒法等。

    EVs表面蛋白(如CD9、CD81、CD63、TSG101、Alix) 与特异性偶联抗体结合，从而捕获EVs。基于免疫亲和力分离的 EVs可以区分 EVs的亚群。下面与磁珠法为例，主要有以下步骤，特点是操作方便，且仪器要求低，提取外泌体纯度高。